merck sigma官网干货|Prestige Antibody®免疫组化操作步骤

IHC实验方法推荐将基于免疫组化的表达谱而开发的Prestige Antibodies®按照以下所描述的标准IHC染色实验方法进行使用。Prestige

IHC实验方法

推荐将基于免疫组化的表达谱而开发的Prestige Antibodies®按照以下所描述的标准IHC染色实验方法进行使用。

脱蜡Prestige Antibody脱蜡

将厚度为4 µm的石蜡切片在50 °C烘烤过夜。在免疫染色之前，在二甲苯和分级乙醇和分级乙醇制蒸馏水中进行脱蜡和水化。在水化过程中，在95％乙醇中的0.3％ H2O2中对内源性过氧化物酶进行封闭5分钟。

标准抗原修复方法

标准抗原修复方法是在pH 6的修复缓冲液中通过使用高压锅炉（Decloaking室，Biocare Medical，Walnut Creek，CA，美国）作为热源而进行的热诱导表位修复（HIER）。

可通过将浸没在修复缓冲液中的TMA玻片在压力锅炉中125°C加热4分钟而进行HIER。在完全煮沸后，玻片会被保留在压力锅炉中并冷却至90 °C。总处理时间约为45分钟。

注意：第一抗体的特定工作稀释比仅作为指南参考。最佳的稀释比必需由用户进行确定。

免疫组化染色程序，AUTOSTAINER 480®

所有的孵育过程都是在室温的。

所有试剂用于每张玻片上的体积都是300 µL。

1. 在洗涤缓冲液中漂洗。

2. 用Ultra V Block孵育5分钟。

3. 在洗涤缓冲液中漂洗（x2）。

4. 用一抗孵育30分钟。

5. 在洗涤缓冲液中漂洗（x3）。

6. 用一抗增强剂孵育20分钟。*

7. 在洗涤缓冲液中漂洗（x2）。*

8. 用标记的聚合物孵育30分钟。

9. 在洗涤缓冲液中漂洗（x2）。

10. 在DAB溶液中显影5分钟。

11. 在蒸馏水中漂洗。

12. 在苏木精中复染5分钟。**

13. 在自来水中漂洗5分钟。**

14. 在1:5稀释的碳酸锂水饱和溶液中漂洗1分钟。**

15. 在自来水中漂洗5分钟。**

16. 在分级乙醇和二甲苯中脱水**

17. 盖上玻片。

* 对于多克隆抗体可忽略第6和7步。

** 第14 - 16步是在组织染色仪（Leica Autostainer XL）中进行的。

试剂

· 洗涤缓冲液（10x浓度）。原始含有0.05% (v/v) Tween 20的工作溶液。加入多余的Tween 20至0.20%的终浓度。

· 修复溶液：Citrate buffer®，pH 6.

· 抗体稀释液。

· Mayer苏木精

· 二甲苯

替代的抗原修复方法

对于特定的抗体，可按照产品数据表中所述，使用替代的修复缓冲液或酶法抗原修复方法。

酶法抗原修复

酶法抗原修复是在免疫染色仪器中进行的，指在室温下将TMA玻片在蛋白酶K中孵育10分钟。

pH 9的修复缓冲液中的热诱导表位修复（Hier）

pH 9的修复缓冲液中的HIER可作为标准的HIER，除非使用了pH 9而非pH 6的修复缓冲液。